رنگ آمیزی معکوس: روشی مؤثر برای تخلیص پروتئین hiv-۱ nef در سیستم بیان پروکاریوتی

سابقه و هدف: پروتئین nef، یکی از پروتئین­های تنظیمی ویروس hiv، دارای اپی­توپ­ های حفاظت شده متعددی است که در افراد آلوده به ایدز پاسخ­ های ایمنی قدرتمندی علیه آنها مشاهده شده است. بنابراین، پروتئین nef کاندید مناسبی برای تولید واکسن می­ باشد. هدف این پژوهش کلونینگ و بیان پروتئین nef در سیستم بیان پروکاریوتی و تخلیص آن به روش رنگ­آمیزی معکوس می­ باشد. مواد و روش­ ها: توالی کدکننده پروتئین nef از وکتور puc19 توسط pcr تکثیر شد و الحاق آن به داخل وکتور بیانی pgex6p2 انجام شد. این سازه طی فرایند ترانسفورماسیون به سویه باکتری e.coli bl21 منتقل شده و القای بیان پروتئین با استفاده از آنتی­رپرسور iptg صورت گرفت. تأیید بیان پروتئین با استفاده از آنالیز sds-page و وسترن بلات توسط آنتی­ بادی ضد nef بررسی گردید. تخلیص پروتئین با استفاده از تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد. نتایج: نتایج آنالیز pcr و هضم آنزیمی وجود باند واضح حدود 648 جفت باز را روی ژل آگاروز تأیید کرد که نشان­گر کلونینگ صحیح ژن nef در وکتور بیان پروکاریوتی pgex6p2 می­ باشد. هم­ چنین، وجود باند حدود 50 کیلودالتون نشان­گر بیان پروتئین nef توسط آنتی­بادی منوکلونال ضد nef در آنالیز وسترن بلات تأیید شد. در نهایت، باند خالص شده پروتئین توسط تکنیک رنگ­آمیزی معکوس به ­دست آورده شد. نتیجه­ گیری: پروتئین نوترکیب nef بیان شده در میزبان e. coli با بازده مناسب توسط روش رنگ­ آمیزی معکوس تخلیص شد. پروتئین nef در آینده به­ عنوان یک آنتی­ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل عفونت ویروس hiv استفاده خواهد شد.